文献解读：一种新而快速的基因芯片检测方法可鉴定37种支原体和多重支原体感染
摘要：
支原体是人类和动物体内的病原体或者共生菌的一部分。支原体属目前就有120多种，而且新成员仍不断被发现。因此，使用统一平行的检测方法迫在眉睫，而不是为每种支原体单独开发测试。在此研究中，我们设计了一个包含70个来自23S rRNA基因的寡核苷酸探针和86个来自tuf基因靶区的探针的DNA芯片。在PCR扩增和生物素化步骤后，芯片杂交可显示特异性鉴定31种支原体属，以及3种无胆甾原体属和3种脲原体属。也可在亚群水平上被识别丝状支原体的成员。在人类、动物或细胞培养物中，在普通感染或多重感染情况下，这检测方法能够准确检测一种或多种支原体。芯片检测的优势包括操作简单、快速、高信息量和可购性。新方法的灵敏度与实时定量荧光PCR相当，样品无需培养，直接检测样品即可。对来自反刍动物和鸟类的60个野生型样品进行芯片分析和变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析，两种测试在98.3%的样本中鉴定出相同支原体。且芯片检测显示多重支原体感染的比例更高，达到35%，显著高于DGGE方法检测 (15%)。其中两个样本中发现四种不同的支原体。这一现象值得更多关注，尤其是它对流行病学和治疗的影响。
支原体属是柔膜体纲的主要分类群之一，目前由120多个种组成。支原体被认为是最小的、可自我复制的生物，具有独特的特征，包括基因组长度较短、缺乏细胞壁和功能代谢途径有限。因此，支原体被认为是最小细胞的模型。然而，尽管它们表面上简单，许多支原体是重要的病原体。例如，在人类中，非典型肺炎与肺炎支原体有关，生殖器官疾病与生殖支原体和脲支原体有关。有四种支原体被列入世界动物卫生组织(OIE)的法定传染病名单，即牛传染性胸膜肺炎(CBPP)，病原体为丝状支原体丝状亚种，传染性山羊胸膜肺炎病原体为山羊支原体山羊肺炎亚种，传染性无乳症病原体为无乳支原体，禽支原体病的病原体为鸡败血支原体、滑膜支原体。其他经济上重要的疾病包括由牛支原体引起的牛的牛呼吸道和乳腺感染，由结膜支原体或绵羊肺炎支原体引起的小反刍动物的眼部和呼吸道感染，以及由猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑膜支原体引起的猪的地方性肺炎、关节炎和多浆膜炎。
细胞培养物中的支原体污染是研究人员和制药公司十分关注的问题，不希望细胞培养物中存在精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾原体、奥拉维尔支原体或发酵支原体从而影响体外实验结果。
尽管已经开展了关于支原体传播和传播途径的研究，但当前流行病学状况的数据依然十分缺乏，只有特定区域的流行病学数据。而且支原体生长缓慢和培养条件苛刻导致支原体诊断困难，以及现有研究的检测方法敏感性和特异性方面不甚理想。
对特定动物物种的流行病学和临床研究通常只考虑主要的代表性的支原体种类，而忽略次要的其他支原体种类。例如，关于牛支原体病大多数认为是牛支原体或丝状支原体亚种造成的，而忽略了可能存在的相关种。在家禽中，鸡败血支原体是最主要的病原体，但也应考虑滑膜支原体等其他支原体。同样的，除了无乳支原体之外，小反刍动物也可携带多种支原体。近年来越来越多诊断证据表明，动物支原体的宿主特异性不高，需要更全面的研究。
无论是在单个动物还是群体水平，对于两种或两种以上支原体多重感染的信息知之甚少，因此关于多种支原体间相互竞争或是共生关系的正确评估也甚少。只有使用有效的的检测方法，才能有效地诊断支原体多重感染。单次PCR反应或ELISA试验不一定能鉴定样品中存在的非典型或混合感染支原体。虽然PCR反应结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)可以检测混合感染，但它是费时、操作繁琐和分析复杂。
相比之下，基因微阵列芯片检测方法为实验室诊断开辟了新的思路。使用大量覆盖许多特异性性基因片段和/或不同微生物的多个基因组区域的检测探针，使该技术检测的重复性、敏感性增加。因此，基因芯片检测可以获得的诊断敏感度比PCR反应的高得多。而微阵列芯片技术在细菌和病毒病原体快速诊断中的应用仍在发展。在目前的研究中，我们开发了一种能够检测主要的人和动物病原体和细胞培养物中支原体的快速基因芯片检测方法，至少可检测出37种支原体。
支原体菌株
Table 1列出了所用的类型菌株，野生菌株来自国家参考实验室CBPP的收集，根据标准方法进行培养。
测试的大部分现场样本来源于英格兰和威尔士地区实验室在2009年至2011年期间进行的调查。表2详述的临床样本已提交给支原体小组。使用Maxwell 16自动系统和Maxwell Tissue DNA Purification Kit提取DNA，并储存在-20℃。表2中包括的参考样本：14F11、20F11、22F11、23F11、33F11和39F11。样品SR00来自培养物收集，样品82A10和83A10作为冻干培养样品。
根据说明书使用High Pure PCR Template Preparation Kit提取培养的支原体菌株的DNA。
对支原体菌株的23S rRNA和tuf基因进行测序
使用引物F 1388(5’-GTT TCC TGG GCA AGG TTC G-3’)和R 1982(5’-CCG TTA TAG TTA CGG CCG CC-3’)用于扩增基因中心结构域的600 bp片段。
使用引物 tuf-064F(5’-ATGCCNCAAAcWMGWGAACAC-3’)和tuf-681R(5’-TRTGACKWCCACTTCWTCTT-3’)扩增序列用于比对同源性。该引物扩增的614 bp中心区是tuf基因的最终靶区，用于进一步探针设计。本研究中确定的新序列已存入GenBank数据库，登记号如下:JQ 390341–JQ 390384(23S rDNA)，JQ 390385–JQ 390408(tuf基因)。
电子序列分析和杂交探针的选择
使用基于Clustal W算法的Vector NTI Advance 11软件，对表1中列出的44个支原体类型的23S rDNA序列进行比对。
从基因库中可获得表1中包含的总共19个柔膜体纲的tuf基因序列。这些序列与中心614 nt区域的24个 de novo序列可结合。而在阵列生产时，M. adleri的序列不可用。
存在两种不同的探针选择方案：a)对于23S rDNA靶区设计探针，基于唯一性人工选择探针结合位点，即每个探针对其同名支原体物种高度特异，并通过BLAST分析进行验证。b)对于tuf靶区设计探针，杂交探针设计包括使用MAFFT软件包6.853b版本的E-INS-I程序进行序列比对校准，再使用内部软件包Clondiag Arraydesign来调整和选择最佳杂交探针。
杂交探针使用以下基本选择标准：i)靶序列的特异性；ii) 解链温度在54-62℃范围内；iii)不存在显著的自我配对。Oligonucleotide Properties Calculator可用于检查这些参数。选定的寡核苷酸探针(70条针对23S rDNA ；86条针对tuf基因)的平均长度为28.4nt(最小23nt,最大34nt，平均Tm值为59.0℃ (54/62)，平均G+C含量为40.3 mol-% (27/57)。
所有探针的核苷酸序列和基本物理参数参考补充材料S4。每种探针在微阵列芯片上都有三倍的重复，包括生物素化的寡核苷酸探针(染色对照)和点样缓冲液(背景对照)。
杂交前扩增(生物素化PCR反应)
5’-生物素化引物F1388和R1982用于扩增包含23S rRNA基因特征区域的约600bp片段。使用5’-生物素化引物tuf-064F和tuf-681R扩增620bp的tuf靶区。杂交前扩增反应在实时定量PCR反应或常规PCR反应方案下进行。
DNA芯片杂交
最佳杂交条件是通过从50℃到60℃的不同杂交温度和杂交后立即进行35℃到47℃条件下的洗涤步骤。根据说明书使用Identibac Hybridisation Kit。
用PatternMatch算法处理AS杂交数据
杂交信号是用Iconoclust软件3.3版处理的。软件使用以下方程式自动计算信号的归一化强度:N1 = 1-(M/BG)，其中N1是归一化强度，M是自动识别的斑点的平均强度，BG是局部背景的强度。理论上，信号强度值的范围从0(无信号)到1(最大信号)。
使用列出每个探针与所有支原体物种的每个靶基因的错配数量的全球支原体特异性表来构建理论杂交模式。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)
通过PCR反应扩增来自现场组织样品的DNA，再进行DGGE分析。
验证性聚合酶链反应
对DGGE和基因微阵列检测中给出不同结果的现场样品使用参考文献中的物种特异性PCR反应方法检测，即对牛支原体、牛鼻支原体、产碱支原体、殊异支原体、绵羊肺炎支原体和精氨酸支原体进行了额外检测。
23S核糖体RNA基因区域分析及探针选择
对真细菌和支原体的23S rDNA序列进行比对显示了高度保守和可变片段在整个基因位点上的交替分布，如Fig 1.A所示。与真细菌不同，所有检查的支原体在2100位片段附近显示23–26个核苷酸的缺失。于是我们对38株支原体、3株无胆甾原体和3株脲原体的这个可变区域进行了测序。Fig1.B中显示了44种柔膜体纲排列片段的相似性图存在相当大的序列多样性。随后，我们系统地探索了这个区域的识别位点。物种特异性杂交探针结合位点的手动选择最终确定了107个寡核苷酸探针，最终70个寡核苷酸探针在两轮特异性测试后被确认。杂交探针仍无法确定下列物种:加州支原体、加拿大支原体、猫支原体、人型支原体、猪鼻支原体和差异脲原体。
Fig 1. 微阵列芯片方法使用的目标区域的序列相似性图。横坐标上的数字表示序列比对基因组中的位置。该图是Vector NTI 11制作生成的，A)基于10种选定真细菌和9种支原体的完整23S rRNA基因的比对(星号显示了在所有柔膜体纲中发现的23-26nt缺失的位置)；B)本研究中包括的所有44种支原体的471-nt特征区域的比对；C)43种支原体的tuf基因的中心614-nt区域的比对。标记为F和R的条分别表示用于扩增的正向和反向引物的位置。
为了便于将测量的信号自动分配给单个物种，通过基于信号强度对靶标和探针之间核苷酸错配数量的预期依赖性，构建了理论杂交模式。以前的研究表明，根据杂交反应的严格程度，由一个、两个或三个错配引起的信号减少是可以直接检测的。所有44种来自23S rDNA区段的理论杂交模式都已输入数据库中。
tuf基因区域分析及探针选择
为了扩大微阵列芯片的识别能力，tuf基因被认为是一个额外的靶标。从基因库中检索到19个基因序列，并与表1中另外24个分类群的de novo序列进行比对。由于序列多样性的程度和性质，无法选择严格的物种特异性探针，因此选择组合的探针组，使用可以鉴别单个物种的特征杂交模式。使用E-INS-I比对43个tuf基因的614-nt片段，产生三个最可变窗口，其位置在图1C中示出。在这三个窗口中，软件选择得到86个满足基本选择标准的寡核苷酸探针。所有理论上预期的tuf模式都已输入数据库。
23S rRNA和tuf探针的验证
用本文的DNA微阵列芯片分析方案共检测了44种支原体类菌株。此外，还对来自37个物种的129个野外菌株进行了检测，这些菌株先前已通过DGGE、DNA测序或免疫荧光得到证实。检测结果在表1中呈现。在27个物种的情况下，23S rDNA探针组合产生了理论上预期的仅由属和种探针信号组成的物种特异性杂交模式。图2显示了该靶区的鉴别潜力，其中显示了鉴定属和种的特异性探针的八种不同牛支原体。
然而，仅23S rDNA探针并不能鉴定表1中的所有支原体类型。除了缺乏特异性探针的六个物种(见上文)，还有四个物种不能通过它们的探针信号准确识别，即精氨酸支原体、鸡毒支原体、生殖支原体和肺炎支原体，因为鉴别探针与相关物种发生交叉反应。此外，丝状支原体及其丝状亚种和山羊亚种，山羊支原体及其山羊亚种和山羊肺炎亚种，以及李氏支原体都可被鉴定为丝状支原体的成员，而丝状支原体亚种和山羊支原体亚种之间可以区分。
tuf基因片段探针提供了额外的识别能力。从Table1中结果可看出，通过tuf基因探针已经明确地识别了34个物种。肺炎支原体和生殖支原体，两者都是相关的人类病原体，23S rDNA靶标探针无法识别两者，但是通过tuf探针上可区分两者，如图3所示。tuf探针在细胞培养物污染物中，如莱氏支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体和口腔支原体也可以鉴定出来。相反，牛支原体/无乳支原体(图2)和脲原体/细小支原体tuf探针无法鉴别， 23S rDNA探针可直接鉴别。
当结合来自两个目标基因探针的结果时，共37个类型菌株可准确鉴别。与23S rDNA位点的发现相似，tuf探针仍未能完全区分丝状支原体的成员，但是对于其两个亚组可以进行一定区分。高序列同源性无法为每一种支原体设计选择区别性探针。其他还有人型支原体及与其紧密相关的精氨酸支原体和门氏支原体，使用目前的探针组合仍无法区分它们。
灵敏度分析
PCR反应-微阵列芯片联合检测的灵敏度通过检测分光光度计定量的牛支原体和分支支原体菌株基因组DNA (1fg至100pg)进行十倍稀释来评估。当单独分析这些支原体时，发现对应于大约100个基因组拷贝的100 fg的DNA足以获得物种特异性杂交模式。为了评估该技术检测共感染的能力，将两种测试DNA以不同的比例混合，通过SYBR Green实时定量荧光PCR反应扩增，并在阵列引物上杂交。牛支原体DNA过量103倍也未导致殊异支原体检测敏感性的降低。这说明了在临床样本中平行和同时检测多种支原体是可行的。
现场样品测试
之前已通过DGGE检测的60个样本(31个来自牛，25个来自小反刍动物，4个来自鸟)在本文微阵列芯片上进行盲测。表2中的结果表明，在59个样本使用两者方法检测结果一致，其中36个样本具有单感染支原体。其中一个DGGE鉴定结果不明确的样本被证实为结膜支原体。
值得注意的是，与DGGE检测多重支原体感染率15.0%相比，微阵列芯片结果显示检测出更多多重支原体感染率，高达35.0%。其中对含有两种不同物种的4个样品的两次测试结果相同。微阵列芯片检测在16例中检测到额外的支原体(其中10例经证实)，而DGGE检测到额外的支原体2例 (1例证实)。在6个样本中，微阵列芯片鉴定了两种以上的支原体物种。作为一个例子，在牛肺组织样品中产碱支原体、牛支原体和分支支原体的检测结果如Fig 4所示。
本文中的DNA微阵列分析已经应用于许多病原微生物的检测。而Volokhov等人描述了另一种支原体检测的阵列芯片技术，该技术主要基于载玻片的微阵列系统，其探针来源于16S–23S基因间转录间隔区并带有荧光标记。该系统可鉴定24种培养的柔膜体纲菌株。本文方法的新颖之处在于将两个不同的探针组合在一起区分相关物种，人工挑选特征区域特异性的23S rRNA基因探针以及源自tuf基因中心区域的探针组合。虽然Volokhov等人描述的探针可根据物种特异性探针的杂交信号进行直接鉴定，但本文方法的探针可精确识别每个物种。使用不同的探针设计策略可在23S核糖体和tuf基因座中观察到物种间序列多样性差异。Fig 1中显示了核糖体靶标中存在一定富集的低相似性位点，所有这些位点都是识别探针的潜在结合位点。
尽管对柔膜体纲的23S rRNA基因区域进行的诊断分析是新的，但对编码延伸因子Tu的基因的功能研究要在十年前就开始。Kamla和同事等人已表明，编码延伸因子Tu的基因作为系统发育标记比16S rRNA基因座更佳。后来，tuf基因应用于实时PCR反应检测支原体物种。在目前的研究中，我们通过组合的方法鉴别支原体。这种鉴别潜力可以再进一步开发，可在微阵列芯片上添加更多感兴趣的支原体物种的探针。总之，双靶标方法提高了微阵列检测的鉴别能力，也提高了物种鉴定的准确性。
本研究的发现证明了微阵列芯片检测的卓越诊断潜力。例如，运行此方法来监测人类样本中所有支原体的可能性(如图3所示)，这是一个省时且经济的极佳方案，同样适用于细胞培养污染物的检测。在兽医诊断中，可应用于检测出现在牛(图2)、小反刍动物(包括无乳支原体、结膜支原体、绵羊肺炎支原体、分支杆菌簇成员)或家禽(包括鸡毒支原体、黑腐支原体、滑膜支原体、下呼吸道支原体、支原体亚型)中的不同支原体，且无需为每种支原体进行单独的测试。
此外，本试验是研究动物多重支原体感染的有效方法。本文检测样本组中发现出现多重感染概率较高，即35%。虽然检测结果存在一定偏差，但研究结果表明多重支原体感染十分常见。此外，关于微生物间的相互协同作用以及它们对流行病学和治疗的影响这些问题还需在未来的研究中解决。
鉴别支原体成员仍然是一个特别困难的问题。即使在最近修订分类之后，仍存在相关性强的种类无法很好鉴别。此外，种类相关异质性研究很少，基于结合的23S rDNA和tuf基因靶标的鉴别所有支原体种类是不可能的。
直接从临床样本中鉴别支原体种类是ArrayStrip分析的重要功能。根据之前研究发现本文的DNA微阵列芯片分析方法的灵敏度相当于实时PCR反应的灵敏度，在Table 2中对60个现场样品的检测结果可证实，一旦样品含有足够量的DNA模板，即可获得了有效的杂交模式，鉴别出支原体种类。而且微阵列芯片检测可取代耗时繁琐的培养实验，并且在诊断样品中未知病原体种类也可以简便快速，无需进行多次检测。
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